高分辨质谱检测蛋白质翻译后修饰

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楼主 2020-10-11 16:07:36
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小编说,文章后面有彩蛋,
我得去看看~
我们知道生命的中心法则是DNA->RNA->蛋白质,但是一个具有成熟功能的蛋白质形成过程到此并没有结束。蛋白质的翻译后修饰是指对氨基酸残基的化学修饰,是蛋白质加工的重要环节,对于蛋白质在细胞内的定位、功能调节、蛋白复合体形成等过程至关重要。也正是因为发生在多个位点的多种翻译后修饰,使得蛋白质组的复杂程度远高于基因组。如下图所示,
我们人类有2万个左右基因,这些基因通过可变剪切和可变转录,会形成约十万个转录本,经过翻译以及翻译后修饰,形成的蛋白质的数目超过百万种。翻译后修饰的种类多达上百种,常见的包括剪切、乙酰化、甲酰化、磷酸化、泛素化、糖基化等等。体内蛋白质的翻译后修饰是由各种修饰酶介导的,这些酶的数量占整个蛋白质组的5%左右,常见的包括磷酸酶、激酶、连接酶、蛋白酶等等。蛋白质的翻译后修饰与多种生命过程和疾病进程密切相关,因此研究蛋白质的翻译后修饰对于理解生命现象有着非常重要的意义。
从方法学上讲,研究单个蛋白质的翻译后修饰并不难,通常采用特异性抗体免疫沉淀富集,结合western blot即可达到对目标蛋白质翻译后修饰进行检测的目的。但是伴随着组学概念和技术的发展,单个蛋白质的翻译后修饰已经很难成为有力的证据,也不再是研究的亮点。建立在组学基础上,对全体蛋白质的翻译后修饰进行大规模检测,并辅以生物信息学方法,对细胞内的信号网络和生命事件进行关联分析,是当下和未来组学研究的主流方向。
 虽然深度蛋白质组学可以对一些蛋白质的翻译后修饰进行研究和分析,但是考虑到特异性和准确性,以及覆盖的深度,通常采用针对各种修饰进行富集以后再进行质谱分析的方法。

今天我们主要介绍
磷酸化蛋白质组学的研究方法。
磷酸化蛋白质组学的研究对象为全体蛋白质的磷酸化事件,可以精确到发生磷酸化修饰的具体位点。磷酸化发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基,主要负责细胞内信号转导和转录活化等分子事件。通过磷酸化修饰,蛋白质的局部电性会发生变化,从而改变蛋白质的折叠构象,以及与DNA、其它蛋白质复合体的亲和性;因此即便相同蛋白不同磷酸化位点的磷酸化水平,也代表了不同的生理意义。
 磷酸化motif分析

富集磷酸化蛋白通常有两种方法:
(1)使用磷酸化抗体对磷酸化蛋白质进行富集;
(2)使用金属氧化物耦联的磁珠对磷酸化肽段进行富集。
通常磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基可以被同一种抗体识别,而磷酸化酪氨酸残基不能被识别丝氨酸/苏氨酸的抗体识别。此外,使用抗体进行富集对抗体效价的依赖性很高。因此,近年来使用金属氧化物耦联的磁珠成为了主流的方法。使用最多的是二氧化钛磁珠,目前多家供应商可以选择(包括Thermo,GE,GLScience等)。在酸性环境中,二氧化钛带正电荷,可与磷酸化修饰的肽段上带负电的磷酸基团特异性结合。利用此特性使用二氧化钛磁珠与蛋白酶解产物孵育,并在结合缓冲液中辅以2,5-二羟基苯甲酸减少非特异性结合,达到特异性富集磷酸化肽段的目的。用碱性洗脱缓冲液洗脱后,利用液相色谱-串联质谱对样品中的肽段进行鉴定并分析。
在对磷酸化蛋白组学进行数据分析时,我们先经过质谱数据搜索,首先获得样品中所有磷酸化蛋白质和磷酸化位点数据集。提供鉴定到磷酸化蛋白质的总数,并从中确认磷酸化位点和磷酸化肽段的数目和信息;并通过GO富集分析进行定位和功能分析,发现发生磷酸化的蛋白质在细胞组分的分布,并发现磷酸化蛋白相关的各种生物功能。此外,专门针对激酶,可以特异性地分析激酶家族以及磷酸化位点和激酶识别motif的鉴定。
新激酶磷酸化位点鉴定和质谱分析
百诺大成
推出磷酸化蛋白质组学服务,希望能在转录组、蛋白质组的基础上,依托我们强大的分析团队,进一步帮助广大科研工作者提升研究深度,发表更高水平的科研文章。

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